Der Nukleäre Rezeptor „Retinoic Acid Receptor related Orphan Receptor α“ (RORα) als Schlüsselfaktor in der Osteoklastogenese und in der Pathogenese der rheumatoiden Arthritis und der Osteoporose

Hintergrund: Der „orphan“ nuklear Rezeptor ROR-alpha (RORα) reguliert ein breites Spektrum physiologischer Prozesse, wie beispielsweise den zirkadianen Rhythmus oder die Myo- und Neurogenese, spielt aber auch in pathologischen Prozessen wie Darmkrebs oder hepatische Steatose eine Rolle. Eine natürliche Mutation von RORα in Mäusen („Staggerer“Mäuse, engl. für taumeln) führt neben neurodegenerativen Merkmalen auch zu einem geschwächten Phänotyp der Entzündungsreaktion, verursacht durch mangelhaft entwickelte, angeborene Lymphozyten-ähnliche Zellen und Th-17 Zellen. Des Weiteren zeigen diese Mäuse einen abnormalen Skelett-Phänotyp mit langen, dünnen Knochen. Osteoklastogenese ist ein Prozess, der bis heute kaum verstanden ist. Er unterteilt sich in mehrere Schritte, welche grob in Differenzierung und Reifung unterteilt werden können. Auf der Suche nach Therapien bei Knochenerkrankungen ist ein Eingreifen in den Prozess der Osteoklastogenese unentbehrlich. Kernrezeptoren eignen sich besonders für therapeutische Interventionen. Natürliche und synthetische RORα Inhibitoren wurden bereits beschrieben. So ist beispielsweise SR3335 ein spezifischer Inhibitor für RORα, während SR1001 sowohl RORα als auch RORγ inhibiert. Zielsetzung: Arthritis zählt zu den häufigsten Ursachen von körperlicher Beeinträchtigung des Bewegungsapparates weltweit. Daher ist es von grundlegender Bedeutung nach therapeutischen Wegen zu suchen, die Symptome und Beschwerden zu unterbinden oder gar rückgängig zu machen. Ziel dieser Studie war es, die Rolle von RORα in der Osteoklastogenese zu bestimmen und ferner, diese Rolle in der Pathogenese der rheumatoiden Arthritis und der Osteoporose zu untersuchen. Darüber hinaus sollte der therapeutische Effekt niedermolekularer RORα Inhibitoren in Entzündungs-abhängigem Knochenabbau und Osteoporose unter Zuhilfenahme präklinischer Tiermodelle untersucht werden. Methodik: Die Expression von RORα wurde in humanem und murinem Knochengewebe bestimmt. Durch TRAP-Färbung von Knie- und Sprunggelenken wurden Osteoklasten identifiziert, RORα wurde mittels Immunfluoreszenz detektiert. Um die Funktionen von RORα in der Osteoklastogenese zu analysieren, wurde RORα genetisch oder pharmakologisch inhibiert oder aber mithilfe von Adenoviren überexprimiert. Eine RORα-abhängige Veränderung der Expression von Osteoklasten-charakteristischen Genen wurde mittels RT-PCR und Western blot bestimmt. RORα-abhängige Phänotypen von murinen Arthritis- und Osteoporose-Modellen (hTNFαtg, SIA, OVX) wurden mit Hilfe von Micro-CT Messungen sowie TRAP-, Trichom- und Hämatoxylin-Färbungen bestimmt. Der molekulare Mechanismus, durch den RORα die Osteoklastogenese steuert, wurde mithilfe von Reporter Versuchen, Ko-Immunpräzipitätion, Chromatin-Immunpräzipitation und Rettungs-Experimenten entschlüsselt. Ergebnisse: Die gemeinsame Färbung mittels TRAP und von RORα im arthritischen und gesunden Knochengewebe zeigte, dass Osteoklasten in der Arthritis eine vergleichsweise höhere RORα Expression haben. Während die Hemmung von RORα zu einer Reduktion der Osteoklastenzahl sowie einer verminderten Expression von für Osteoklasten charakteristischen Genen (TRAP, OSCAR, NFATC1 und CATHEPSIN K) führte, verursachte eine Überexpression von RORα den gegenteiligen Effekt. Darüber hinaus zeigte eine zeitabhängige Hemmung von RORα, dass RORα besonders für die frühen Differenzierungsphasen wichtig ist. Die in vivo Inhibition mittels niedermolekularen Inhibitoren (SR3335 und SR1001) in verschiedenen murinen Arthritis-Modellen zeigte einen schützenden Effekt gegenüber lokalem und systemischem Knochenabbau. Die Hemmung von RORα senkte die Expression von c-Jun, wohingegen die Überexpression von RORα diese steigerte. Des Weiteren zeigten c-Jun-Luziferase-Reporter Versuche, dass ROR-alpha die Promotor Aktivität von c-Jun erhöht. In einem Rettungsversuch konnte gezeigt werden, dass mittels siRNA herunterreguliertes c-Jun durch die Überexpression von RORα nicht kompensiert werden kann. Dies deutet darauf hin, dass RORα die Osteoklastogenese c-Jun-abhängig induziert. Schlussfolgerung: Durch diese Studie konnte die bisher noch nicht bekannte Rolle von RORα als zentraler Regulator der Osteoklastogenese bestimmt werden. Daher übernimmt RORα die Schlüsselrolle in der Pathogenese rheumatoider Arthritis und Osteoporose. Es konnte erstmals gezeigt werden, dass RORα die Osteoklastogenese durch c-Jun induziert.Background: ROR-alpha (RORα) is an orphan nuclear receptor implicated in various physiological processes including circadian rhythm, myogenesis and neurogenesis as well as in pathological processes like colon cancer and hepatic steatosis. Naturally occurring RORα mutant mice (staggerer mice) show an impaired inflammatory phenotype induced by altered development of innate lymphocytes and Th-17 cells. Besides, these mice also display an abnormal skeletal phenotype with long, thin bones. Osteoclastogenesis is a process which is to date incompletely understood. It takes place in a series of steps which can be roughly classified in differentiation and maturation phases. In search for therapies against bone disorders like rheumatoid arthritis and osteoporosis is exploitation of osteoclastogenesis inevitable. Nuclear receptors are common targets for therapeutic intervention. Natural and synthetic inhibitors of RORα have been described. SR3335 is a RORα specific inhibitor, whereas SR1001 inhibits both RORα and ROR-gamma (RORγ). Objectives: In this study, we aimed to elucidate the role of RORα in osteoclastogenesis and evaluate its contribution to the pathogenesis of rheumatoid arthritis and osteoporosis. Our main goal, however, was to assess the therapeutic effects of small molecule inhibitors of RORα in preclinical models of inflammatory bone loss and osteoporosis. Methods: The expression of RORα in osteoclasts of human and mouse bone tissue was determined by TRAP-stained knee and ankle joints co-stained with RORα via immunofluorescence. The role of RORα in osteoclastogenesis was analysed by both RORα inhibition (genetically and using small molecules) and RORα overexpression with adenovirus as well as RORα overexpressing plasmids. Expression variations in osteoclast markers were quantified using real-time PCR and western blot. The effect of RORα inhibition on the phenotype of mouse models of arthritis and of osteoporosis (hTNFαtg mice, SIA mice, OVX mice) was determined by micro-computed tomography, TRAP-, trichrome- and haematoxylin staining. The molecular mechanisms underlying the function of RORα in osteoclastogenesis was elucidated using reporter-assays, Co-Immunoprecipitations, Chromatin immunoprecipitations and rescue experiments. An osteoclast-specific RORα knock-out was achieved with the Cre/LoxP system. Transplantation of staggerer bone marrow cells into irradiated wildtype C57BL/6J mice was done to mimic a hematopoietic conditional RORα knock-out. Result: TRAP and RORα co-staining showed a higher RORα expression in osteoclasts of arthritic bone tissue compared to healthy controls. While RORα inhibition resulted in reduced osteoclast counts and decreased expression levels of osteoclast markers like TRAP, OSCAR, NFATC1 and CATHEPSIN K, RORα overexpression showed the opposite effect. RORα is important for the early differentiating stages of osteoclastogenesis, but is dispensable in later stages. In vivo targeting of RORα using small molecules (SR3335 and SR1001) in different arthritis mouse models protected these mice from local and systemic bone loss. RORα inhibition decreased the expression of c-Jun, whereas RORα overexpression elevated c-Jun expression in osteoclasts. In addition, RORα enhanced c-Jun promoter activity. The attempt to rescue c-Jun-siRNA knock-down with an overexpression of RORα showed that RORα cannot compensate c-Jun deficiency, suggesting that the effects of RORα on osteoclastogenesis require c-Jun. Conclusion: Here, we demonstrate that RORα is a novel and central regulator of osteoclastogenesis, and consequently a key player in the pathogenesis of rheumatoid arthritis and osteoporosis. Our data also provide evidence that RORα induces osteoclastogenesis through the AP-1 (c-Jun) pathway